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      蛋白互作
      时间:2021-04-20

      蛋白质间的相互作用构成了细胞生化反应网络的一个主要组成部分{亚博app买球主词}{亚博app买球主词},蛋白-蛋白互作网络与转录调控网络对调控细胞及其信号有重要意义{亚博app买球主词}{亚博app买球主词}{亚博app买球主词}。本文总结了七种蛋白质相互作用的方法{亚博app买球主词}。

      01免疫共沉淀技术
      免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法{亚博app买球主词}。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法{亚博app买球主词}。 其基本原理是:细胞裂解液中加入抗体{亚博app买球主词}{亚博app买球主词},与抗原形成特异免疫复合物{亚博app买球主词}{亚博app买球主词}{亚博app买球主词},经过洗脱{亚博app买球主词}{亚博app买球主词},收集免疫复合物{亚博app买球主词}{亚博app买球主词}{亚博app买球主词},然后进行SDS-PAGE及Western blotting分析。

      但这种方法有两个缺陷:一是两种蛋白质的结合可能不是直接结合,而可能有第三者在中间起桥梁作用{亚博app买球主词}{亚博app买球主词};二是必须在实验前预测目的蛋白是什么{亚博app买球主词},以选择最后检测的抗体{亚博app买球主词}{亚博app买球主词},所以{亚博app买球主词}{亚博app买球主词}{亚博app买球主词},若预测不正确,实验就得不到结果,方法本身具有冒险性{亚博app买球主词}{亚博app买球主词}。

      02pull-down技术

      蛋白质相互作用的类型有牢固型相互作用和暂时型相互作用两种{亚博app买球主词}{亚博app买球主词}。牢固型相互作用以多亚基蛋白复合体常见{亚博app买球主词},最好通过免疫共沉淀(Co-IP) {亚博app买球主词}{亚博app买球主词}{亚博app买球主词}、Pull-down技术或Far-western法研究。Pull-down技术用固相化的{亚博app买球主词}{亚博app买球主词}、已标记的饵蛋白或标签蛋白(生物素-{亚博app买球主词}{亚博app买球主词}{亚博app买球主词}、PolyHis-或GST-),从细胞裂解液中钓出与之相互作用的蛋白{亚博app买球主词}{亚博app买球主词}。通过Pull-down技术可以确定已知的蛋白与钓出蛋白或已纯化的相关蛋白间的相互作用关系{亚博app买球主词}{亚博app买球主词}{亚博app买球主词}{亚博app买球主词},从体外传路或翻译体系中检测出蛋白相互作用关系{亚博app买球主词}。

      03酵母双杂交系统

      酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后{亚博app买球主词},诱饵蛋白结合于报道基因的启动子,启动报道基因在酵母细胞内的表达{亚博app买球主词}{亚博app买球主词},如果检测到报道基因的表达产物{亚博app买球主词},则说明两者之间有相互作用{亚博app买球主词},反之则两者之间没有相互作用{亚博app买球主词}{亚博app买球主词}。将这种技术微量化{亚博app买球主词}、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。在实际工作中{亚博app买球主词}{亚博app买球主词},人们根据需要发展了单杂交系统{亚博app买球主词}、三杂交系统和反向杂交系统等。此外{亚博app买球主词},酵母双杂交系统的作用也已扩展至对蛋白质的鉴定{亚博app买球主词}{亚博app买球主词}{亚博app买球主词}。

      04噬菌体展示技术

      在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单克隆抗体的DNA序列,当噬菌体生长时{亚博app买球主词},表面就表达出相应的单抗{亚博app买球主词},再将噬菌体过柱{亚博app买球主词},柱上若含目的蛋白{亚博app买球主词}{亚博app买球主词}{亚博app买球主词}{亚博app买球主词},就会与相应抗体特异性结合,这被称为噬菌体展示技术{亚博app买球主词}。此技术也主要用于研究蛋白质之间的相互作用,不仅有高通量及简便的特点{亚博app买球主词}{亚博app买球主词},还具有直接得到基因、高选择性的筛选复杂混合物、在筛选过程中通过适当改变条件可以直接评价相互结合的特异性等优点{亚博app买球主词}{亚博app买球主词}{亚博app买球主词}。目前{亚博app买球主词}{亚博app买球主词}{亚博app买球主词},用优化的噬菌体展示技术{亚博app买球主词}{亚博app买球主词},已经展示了人和鼠的两种特殊细胞系的cDNA文库,并分离出了人上皮生长因子信号传导途径中的信号分子{亚博app买球主词}{亚博app买球主词}{亚博app买球主词}。

      05等离子共振技术

      表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance,SPR)已成为蛋白质相互作用研究中的新手段{亚博app买球主词}。它的原理是利用一种纳米级的薄膜吸附上“诱饵蛋白”{亚博app买球主词}{亚博app买球主词},当待测蛋白与诱饵蛋白结合后{亚博app买球主词},薄膜的共振性质会发生改变{亚博app买球主词}{亚博app买球主词}{亚博app买球主词}{亚博app买球主词},通过检测便可知这两种蛋白的结合情况{亚博app买球主词}{亚博app买球主词}。SPR技术的优点是不需标记物或染料{亚博app买球主词}{亚博app买球主词},反应过程可实时监控{亚博app买球主词}。测定快速且安全{亚博app买球主词},还可用于检测蛋白一核酸及其它生物大分子之间的相互作用{亚博app买球主词}。

      06荧光能量转移技术

      荧光共振能量转移(FRET )广泛用于研究分子间的距离及其相互作用;与荧光显微镜结合,可定量获取有关生物活体内蛋白质{亚博app买球主词}{亚博app买球主词}{亚博app买球主词}、脂类{亚博app买球主词}、DNA 和RNA 的时空信息。随着绿色荧光蛋白(GFP)的发展,FRET 荧光显微镜有可能实时测量活体细胞内分子的动态性质。提出了一种定量测量FRET效率以及供体与受体间距离的简单方法,仅需使用一组滤光片和测量一个比值,利用供体和受体的发射谱消除光谱间的串扰{亚博app买球主词}{亚博app买球主词}。该方法简单快速{亚博app买球主词},可实时定量测量FRET 的效率和供体与受体间的距离{亚博app买球主词},尤其适用于基于GFP 的供体受体对。

      07抗体与蛋白质阵列技术
      蛋白芯片技术的出现给蛋白质组学研究带来新的思路{亚博app买球主词}。蛋白质组学研究中一个主要的内容就是研究在不同生理状态下蛋白水平的量变{亚博app买球主词}{亚博app买球主词},微型化{亚博app买球主词}{亚博app买球主词}{亚博app买球主词},集成化{亚博app买球主词},高通量化的抗体芯片就是一个非常好的研究工具{亚博app买球主词}{亚博app买球主词},它也是芯片中发展最快的芯片{亚博app买球主词}{亚博app买球主词}{亚博app买球主词},而且在技术上已经日益成熟。这些抗体芯片有的已经在向临床应用上发展,比如肿瘤标志物抗体芯片等{亚博app买球主词},还有很多已经应用到各个领域里。
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